微生物次級(jí)代謝物因其產(chǎn)生過(guò)程、條件以及自身性質(zhì)的特殊性，對(duì)其進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估是微生物農(nóng)藥登記評(píng)審中的難點(diǎn)，我國(guó)現(xiàn)行《農(nóng)藥登記資料要求》并未對(duì)該部分內(nèi)容提出相關(guān)要求。經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（OECD）2018年發(fā)布的98號(hào)工作文件（Working Document on the Risk Assessment of Secondary Metabolites of Microbial Biocontrol Agent）（以下簡(jiǎn)稱“OECD98號(hào)文件”）對(duì)微生物農(nóng)藥中次級(jí)代謝物的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估進(jìn)行了詳細(xì)介紹，本文對(duì)其中的部分重點(diǎn)內(nèi)容進(jìn)行了總結(jié)和梳理，供管理部門制定相關(guān)政策及農(nóng)藥企業(yè)申請(qǐng)產(chǎn)品境外登記時(shí)提供參考。

微生物代謝物分為初級(jí)代謝物（Primary Metabolites）和次級(jí)代謝物（Secondary Metabolites 以下稱為SM），前者是指微生物產(chǎn)生的，對(duì)其生長(zhǎng)、擴(kuò)展或繁殖必需的化合物，后者是指微生物產(chǎn)生的，對(duì)其生長(zhǎng)、擴(kuò)展或繁殖非必需的化合物，且次級(jí)代謝物由初級(jí)代謝物通過(guò)生化合成產(chǎn)生。相關(guān)次級(jí)代謝物（relevant secondary metabolite）是指對(duì)人類健康和/或環(huán)境可能構(gòu)成一定危害的次級(jí)代謝物。

雖然對(duì)SM的管理通常參照化學(xué)農(nóng)藥的要求，但SM與化學(xué)農(nóng)藥代謝物不同之處在于：SM通常為一組化合物，其產(chǎn)生受其他生物或非生物因素的影響，或在微生物與寄主或靶標(biāo)生物接觸時(shí)才產(chǎn)生，部分為有效成分的組成部分。SM主要由放線菌和真菌產(chǎn)生，已經(jīng)被確認(rèn)的SM主要包括：真菌毒素（mycotoxin）、植物毒素（phytotoxin）、外毒素(exotoxin)和抗生素（antibotics）。在OECD98號(hào)文件中，SM不包括酶和內(nèi)毒素。內(nèi)毒素一般由革蘭氏陰性菌產(chǎn)生，但蘇云金芽孢桿菌也可產(chǎn)生內(nèi)毒素，稱為delta毒素，即具有殺蟲活性的晶體蛋白，是該類產(chǎn)品生物活性及有效成分的一部分。

對(duì)微生物中SM的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估主要依賴基礎(chǔ)信息、環(huán)境中暴露和持久性等數(shù)據(jù)進(jìn)行。參照OECD對(duì)植物源農(nóng)藥的管理模式，為便捷對(duì)SM的管理，該工作文件依據(jù)現(xiàn)有信息將微生物農(nóng)藥分為以下3類：1.已知對(duì)人類、動(dòng)物和環(huán)境無(wú)負(fù)面影響的微生物。2.根據(jù)分類及現(xiàn)有信息，可能產(chǎn)生對(duì)人類、動(dòng)物和環(huán)境造成危害的SM的微生物，此種情況下需要對(duì)SM進(jìn)行定性定量分析，如可產(chǎn)生真菌毒素的木霉菌（Trichoderma spp）。3.無(wú)可靠相關(guān)信息的微生物。

1. 基礎(chǔ)信息

SM的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估從基礎(chǔ)信息開始，其內(nèi)容包括：1.產(chǎn)生SM的微生物的特性，包括鑒別和分類、生理習(xí)性、繁殖能力、作用機(jī)制、寄主范圍、增殖條件和生產(chǎn)工藝、在環(huán)境或食品/飼料中的分布、生成和暴露，以及與已知能夠產(chǎn)生相同SM菌種的相關(guān)性等。但同一SM可由相近或完全不同的菌種產(chǎn)生，因此對(duì)于一個(gè)全新的微生物農(nóng)藥，即使沒有與已知可產(chǎn)生同一SM的菌種有關(guān)聯(lián)，也不能完全排除其產(chǎn)生SM的可能性。2.微生物產(chǎn)品特性，包括產(chǎn)品劑型和詳細(xì)的產(chǎn)品組成、防治作物和對(duì)象、使用時(shí)間和劑量等。3.SM的特性，包括結(jié)構(gòu)和命名、存在于細(xì)胞里或外、產(chǎn)生的基因代碼序列、穩(wěn)定性、作用機(jī)制、對(duì)人類/哺乳動(dòng)物或其他非靶標(biāo)生物的影響、產(chǎn)生的環(huán)境條件及調(diào)節(jié)機(jī)制，以及對(duì)微生物產(chǎn)品作用機(jī)制的影響等。4.微生物與靶標(biāo)生物的相關(guān)性，包括防治對(duì)象和藥效數(shù)據(jù)等。5.微生物與非靶標(biāo)生物的關(guān)系，包括微生物不屬于有效抗生素和人類致病菌的信息、相關(guān)的醫(yī)學(xué)報(bào)告以及非靶標(biāo)生物清單等。此外，公開發(fā)表的相關(guān)信息以及QSAR數(shù)據(jù)等，也可作為對(duì)SM進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)的輔助數(shù)據(jù)。但用QSAR對(duì)SM使進(jìn)行評(píng)估的難點(diǎn)在于，其往往無(wú)CAS號(hào)或SMILES碼或準(zhǔn)確的分子結(jié)構(gòu)，或?yàn)橐唤M混合物，因此無(wú)法獲得QSAR模型的輸入?yún)?shù)。對(duì)SM構(gòu)效關(guān)系評(píng)價(jià)使用最多的為Norine 數(shù)據(jù)庫(kù)，該數(shù)據(jù)庫(kù)收錄了1 000多種肽類化合物信息，涵蓋化合物結(jié)構(gòu)、活性、以及產(chǎn)生的有機(jī)物種類等。如基礎(chǔ)信息足以證明微生物產(chǎn)品及其產(chǎn)生的SM的安全性，則無(wú)需對(duì)SM進(jìn)行進(jìn)一步的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。

2. 環(huán)境中暴露和持久性

對(duì)SM的暴露評(píng)估主要依據(jù)產(chǎn)品劑型、有效成分含量、防治作物、推薦的使用劑量、使用方法、地點(diǎn)和時(shí)間以及SM在自然界中存在的濃度等信息進(jìn)行。SM生成途徑有2條：1是在微生物生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生；2是在前體分子中存在或與寄主或致病菌接觸時(shí)產(chǎn)生。只有在前一種情況下，用微生物產(chǎn)品作為樣品進(jìn)行的相關(guān)試驗(yàn)才對(duì)評(píng)價(jià)SM的安全性有用。

表：不同的使用方式對(duì)應(yīng)的、可能受SM影響的非靶標(biāo)組

                 ¹如SM為植物毒素     

對(duì)SM的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估需同時(shí)考慮其穩(wěn)定性和持久性。從現(xiàn)有的數(shù)據(jù)來(lái)看，昆蟲病原真菌產(chǎn)生的SM有以下幾個(gè)特點(diǎn)：1.在液體發(fā)酵介質(zhì)中很快降解；2.在植物中不存在或含量低于檢測(cè)限；3.僅在特定的條件下穩(wěn)定；4.在使用現(xiàn)場(chǎng)因?yàn)闇囟群妥贤饩€等因素很快分解。因此當(dāng)暴露到正常環(huán)境條件下時(shí)，昆蟲病原真菌產(chǎn)生的SM并不穩(wěn)定。對(duì)于木霉菌和細(xì)菌等產(chǎn)生的SM，目前已知的信息還很少。但SM的穩(wěn)定性并不能完全依據(jù)DT50/DT90的值來(lái)判定，因具有代謝活性的微生物在使用后仍可能繼續(xù)產(chǎn)生SM。

3. 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

對(duì)SM進(jìn)行的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估涉及4個(gè)部分內(nèi)容：1.毒性試驗(yàn)；2.膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估；3.職業(yè)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估；4.非靶標(biāo)組風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。對(duì)于毒性試驗(yàn)部分，如前所述，只有SM在微生物生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生，即用于試驗(yàn)樣品的微生物產(chǎn)品中含有該SM時(shí)，進(jìn)行的相關(guān)試驗(yàn)才可用于SM評(píng)價(jià)。

在下列幾種情況下需要對(duì)SM進(jìn)行膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估：1.基礎(chǔ)信息部分?jǐn)?shù)據(jù)顯示微生物產(chǎn)生的SM存在人體毒性風(fēng)險(xiǎn)；2.與已知產(chǎn)生真菌毒素的菌種相近（見工作文件8.2.1部分表3），因?yàn)檎婢舅乜赡苡兄掳┬?、致突變性或生殖毒性?.與已知的人類致病菌相近（見工作文件8.2.2部分）。如有證據(jù)支持可能形成有害的SM，則需要按照下列步驟進(jìn)行進(jìn)一步評(píng)估：1.產(chǎn)生有害SM的基因序列是否存在；2.根據(jù)使用方法和劑型確定暴露可能性，其中葉面使用風(fēng)險(xiǎn)性最高，與之相比，因?qū)е律攀潮┞兜目赡苄暂^低，土壤和種子處理劑則相對(duì)安全，如有充足理由證明SM不會(huì)構(gòu)成職業(yè)、路人或居民風(fēng)險(xiǎn)或膳食風(fēng)險(xiǎn)，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估也可到此為止。否則繼續(xù)以下步驟：3.確認(rèn)使用過(guò)程中產(chǎn)生的SM濃度，此過(guò)程需要對(duì)SM進(jìn)行定量或半定量分析。4.確定毒性數(shù)據(jù)。如無(wú)毒性相關(guān)數(shù)據(jù)，也可以用食品中污染物允許最大含量確定真菌毒素的含量是否可接受，如歐盟No1881/2006號(hào)條例中規(guī)定了食品中污染物的限量，美國(guó)、中國(guó)、新加坡和巴西等也都規(guī)定了真菌毒素在食品中的限量指標(biāo)?；虿捎枚纠韺W(xué)關(guān)注閾值（TTC）的方法，如基因毒性致癌物為1.5ug/人/天或25ng/kg體重/天。結(jié)合膳食消費(fèi)數(shù)據(jù)，有可能計(jì)算出食品中所允許的最大量。但TTC對(duì)一些致癌性非常高的物質(zhì)如黃曲霉素（aflatoxin）不適用。

職業(yè)工人和操作者也可能暴露于SM。主要暴露途徑為經(jīng)皮或吸入途徑，而較少通過(guò)眼部或經(jīng)口途徑。如果經(jīng)皮或吸入毒性較高，則需要進(jìn)行定量的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。如木霉菌產(chǎn)生的Trichothecenes為細(xì)胞膜破壞性毒素，可能造成皮膚損傷或系統(tǒng)性疾病。尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）為除草劑，也能夠產(chǎn)生一系列的真菌毒素。對(duì)于在微生物生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的SM，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估可以按照目前傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥的方法進(jìn)行。

對(duì)于SM的非靶標(biāo)組風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，存在傳統(tǒng)生態(tài)毒理試驗(yàn)的適用性、標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)介質(zhì)制備、提取程序標(biāo)準(zhǔn)化、試驗(yàn)數(shù)據(jù)重復(fù)性等多種問(wèn)題，但可依據(jù)微生物及SM的相關(guān)特性申請(qǐng)豁免。如假單胞菌（Pseudomonas）和芽孢桿菌（Bacillus）的土壤和種子處理產(chǎn)品，因其會(huì)在植物根部形成一層生物膜，對(duì)非靶標(biāo)組的暴露受到限制，另外，其生成的代謝物-脂肽通過(guò)破壞致病菌的細(xì)胞膜產(chǎn)生作用，可以排除其對(duì)非靶標(biāo)組的潛在影響，且這些微生物均為土壤中普遍存在的，也不太可能對(duì)土壤中有重要環(huán)境或生態(tài)環(huán)境影響的物種構(gòu)成風(fēng)險(xiǎn)。

由此可見，對(duì)微生物中次級(jí)代謝物的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，較難制定統(tǒng)一的要求和流程，需要結(jié)合微生物、代謝物本身特性以及使用條件等多種情況而定，由于農(nóng)藥相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)缺乏，部分限量要求還需參照食品中的限量要求執(zhí)行，在工作文件8.3部分-全球已獲登記的微生物農(nóng)藥產(chǎn)品清單（微生物農(nóng)藥電子手冊(cè)中收錄數(shù)據(jù)）中，也僅有少量明確了次級(jí)代謝物信息。因此，為鼓勵(lì)微生物農(nóng)藥發(fā)展，結(jié)合現(xiàn)有微生物農(nóng)藥作用機(jī)制和應(yīng)用場(chǎng)所等特點(diǎn)，如果明確不屬于已知的人畜或脊椎動(dòng)物病原體的微生物，或雖有研究表明其可能產(chǎn)生有害SM，但產(chǎn)生條件或使用方式導(dǎo)致其暴露的可能性很低，國(guó)家農(nóng)藥登記管理部門可考慮降低其風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估要求，同時(shí)加強(qiáng)對(duì)新微生物品種的審批，對(duì)已知危害性較大的SM建立定性定量檢測(cè)方法，在促進(jìn)微生物農(nóng)藥發(fā)展的同時(shí)規(guī)范其管理。

該工作文件同時(shí)給出了其他有關(guān)SM的數(shù)據(jù)庫(kù)信息，以及全球登記的產(chǎn)生真菌毒素的真菌農(nóng)藥清單、植物毒素清單（文獻(xiàn)數(shù)據(jù)）和微生物農(nóng)藥電子手冊(cè)2014版中收集的全球登記的微生物農(nóng)藥清單等，可為我國(guó)農(nóng)藥管理部門在制定次級(jí)代謝物管理相關(guān)政策時(shí)提供參考。